مقایسه کارآیی روش‌های پی‌سی‌آر معمولی، nested-PCR، real-time PCR و تکثیر هم‌دمای وابسته به حلقه(LAMP) در ردیابی عامل بیماری هوآنگ‌لونگ‌بینگ مرکبات در ایران*

بیماری هوانگ‌لونگ‌بینگ (HLB) یا میوه‌سبز مرکبات یکی از بیماری‌های خطرناک مرکبات در دنیا است که اخیراٌ از ایران نیز گزارش شده است. برای انجام مدیریت بهینه بیماری HLB، ردیابی به موقع و سریع بیماری در باغ‌های مرکبات امری اجتناب‌ناپذیر است. به منظور مقایسه کارآیی روش‌های پی‌سی‌آر معمولی، nested-PCR، real-time PCR و تکثیر هم دمای وابسته به حلقه (Loop-mediated Isothermal Amplification) در ردیابی Candidatus Liberibacter asiaticus، عامل بیماری HLB در ایران، از نمونه‌های برگ مربوط به یک درخت پرتقال آلوده و یک درخت سالم استخراج دی‌ان‌اِی کل انجام شد. سپس در مقادیر مختلف  دی ان  ای کل ( از 100 نانوگرم تا 1/0 فمتوگرم) از گیاه آلوده و سالم ردیابی عامل بیماری با آزمون پی‌سی‌آر معمولی (با چهار آغازگر مختلف)، nested-PCR  (با سه مجموعه آغازگر مختلف)،  real-time PCR (با یک جفت آغازگر) و LAMP (با دو مجموعه آغازگر مختلف) انجام و حساسیت، اختصاصیت و صحت برای هر روش بررسی شد. کلیه روش‌ها، به‌جز پی‌سی‌آر معمولی با آغازگر F1/R1 (90 درصد)، در مقادیر 100، 10 و 1 نانوگرم  از دی‌ان‌اِی کل با حساسیت 100 درصد عامل بیماری را ردیابی کردند. روش پی‌سی‌آر معمولی (با هر کدام از چهار آغازگر) با مقدار 100 پیکوگرم DNA، به‌طور میانگین عامل بیماری را در حدود 30 درصد ردیابی نمود ولی در مقادیر 1 پیکوگرم تا 1/0 فمتوگرم نتوانست عامل بیماری را ردیابی نماید. روش LAMP تا میزان 10 پیکوگرم از دی‌ان‌اِی کل را با حساسیت 20 تا 30 درصد ردیابی نمود ولی در مقادیر پایین‌تر از این مقدار (1 پیکوگرم و کمتر از DNA)، با هرکدام از دو مجموعه آغازگر قادر به ردیابی عامل بیماری نبود. حساسیت روش LAMP شبیه یا در برخی مقادیر DNA اندکی بیشتر از پی‌سی‌آر معمولی بوده ولی سریع‌تر و ارزان‌تر از آن است. روش nested-PCR (با هر سه جفت آغازگر برای دور دوم)، عامل بیماری را با حساسیت 100 درصد تا مقدار 1 پیکوگرم دی‌ان‌اِی کل ردیابی کرده و در کمترین مقدار دی‌ان‌اِی کل یعنی 1/0 فمتوگرم نیز با حساسیت حدود 30 درصد عامل بیماری را ردیابی نمود. روش real-time PCR تا 10 فمتوگرم DNA، عامل بیماری را با حساسیت 100 درصد و در مقادیر 1 و 1/0 فمتوگرم DNA، عامل بیماری را با حساسیت 90 درصد ردیابی نمود و بیشترین حساسیت را نشان داد؛ با وجود این، از عیوب این روش وقوع بیشتر نتایج مثبت کاذب نسبت به سایر روش‌ها می‌باشد. براساس نتایج به دست آمده به دلیل حساسیت بالای روش‌های real-time PCR و nested-PCR در ردیابی عامل بیماری HLB، استفاده از این روش‌ها در ردیابی درختان آلوده به‌ویژه در مناطقی که بیماری بتازگی وارد شده یا خطر آلودگی وجود دارد در کنار سایر روش‌های ردیابی پیشنهاد می‌شود. در بسیاری از شرایط استفاده از روش nested-PCR با توجه به کمتر بودن نتایج مثبت کاذب و ارزان‌تر بودن نسبت به روش real-time PCR می‌تواند انتخاب مناسب‌تری برای ردیابی بیماریHLB  باشد.